Vários fatores podem influenciar negativamente a produção e a qualidade do leite de búfalas, como a mastite que consiste na inflamação da glândula mamária e pode ser de origem multifatorial. Desta forma, este trabalho teve como objetivo identificar os principais agentes bacterianos na mastite clínica e subclínica em búfalas na Baixada Maranhense. Foram avaliadas 64 búfalas, distribuídos em 10 rebanhos. Onde seis animais apresentaram resultados positivos no Califórnia Mastitis Test (CMT).As amostras foram coletadas e cultivadas em ágar sangue equino 5% e ágar MacConkey por um período de 24h as 48h. Para caracterização morfológica foi feita coloração de Gram e os testes bioquímicos. A frequência de animais positivos foi 9,37% (n=6/64). A frequência de rebanhos positivos foi 50% (n=5/10) e municípios 100% (n=5/5). Destes seis animais, foram coletadas 11 amostras. Resultados demonstram bactérias dos gêneros Staphylococcus sp., sendo Staphylococcus não-aureus e Staphylococcus aureus. Também foram isoladas bactérias dos gêneros Klebsiella sp., Trueperella sp., Microbacterium sp., Bacillussp.. No antibiograma as bactérias do gênero Staphylococcus sp. apresentaram resistência a Penicilina G (7%), Eritromicina (23%) e Cotrimoxazol (6%), as bactérias do gênero Trueperella sp. apresentaram resistência a Tetraciclina (6%). Os demais antibióticos demonstraram sensibilidade para todas as amostras: Amoxicilina + Ácido Clavulânico (30 μcg), Enrofloxacina (5 μcg), Ceftiofur (30 μcg), Cefalexina (30 μcg), Florfenicol (30 μcg) e Gentamicina (10 μcg). Conclui-se que a presença desses agentes bacterianos está associada a falhas na higiene durante a ordenha, ao tipo de criação, efeitos ambientais, fisiológicos dos animais e a ação de microrganismos. Medidas de manejo sanitário e de prevenção da mastite bubalina devem ser valorizadas de forma que se reduza a incidência da enfermidade nos rebanhos e consequentemente, o uso de antimicrobianos na bubalinocultura leiteira, o que pode ser alcançado por ações de extensão rural e assistência técnica qualificada. Faz-se necessário a criação de um programa de controle de mastite que identifique os agentes e sua suscetibilidade aos antibióticos usados para optar pela melhor escolha do tratamento.